一、制定背景
橡胶树是我国热区重要的经济作物，其生产的天然橡胶是关系国计民生的重要战略资源。目前，橡胶树品种鉴定以形态鉴定为主要依据，鉴定周期长、易受环境因素影响，而且对于一些性状差异较小、亲缘关系较近品种的鉴定十分困难。因此，亟需准确的分子标记方法来对橡胶树种质资源和品种进行鉴定。
在植物DNA指纹图谱构建中，简单重复序列（Simple Sequence Repeat ，SSR）荧光标记毛细管电泳法已被广泛应用于作物种质资源鉴定和评价，在品种甄别与物种保护中发挥着重要作用。应用SSR荧光标记引物和毛细管电泳检测技术鉴别橡胶树品种，构建橡胶树标准DNA指纹图谱库，具有重复性好、稳定可靠、检测快速的优点，可为橡胶树品种的鉴别、甄别，以及分子辅助育种提供重要依据。
2026年8月26日，农业农村部公告第1056号发布了由中国热带农业科学院橡胶研究所牵头编制的《橡胶树品种鉴定 SSR分子标记法》（NY/T 5684—2026），该标准自2027年2月1日起实施，将填补国内外橡胶树品种鉴定标准的空白。
二、核心技术与原理
橡胶树不同品种基因组中，SSR的重复次数存在可稳定遗传的差异。提取供试样品DNA，采用SSR引物进行扩增及电泳检测，依据扩增片段长度差异，可实现品种区分与鉴定。关键技术包括：利用SDS提取液提取基因组DNA，采用特定引物进行PCR扩增，通过垂直板变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或荧光毛细管电泳检测扩增片段大小，与参照品种比对确定等位变异。
三、仪器设备与试剂
主要仪器包括：PCR扩增仪、高压电泳仪（最高电压不低于2000V）、离心机、核酸浓度测定仪、垂直电泳槽、DNA分析仪（用于荧光毛细管电泳，最低分辨率1bp）等。主要试剂包括：CTAB、三氯甲烷、异戊醇、Tris、EDTA、甲叉双丙烯酰胺、氯化钠、dNTPs、Taq酶、SSR引物、丙烯酰胺、硝酸银等。所有试剂均要求分析纯以上。
四、操作程序详解
标准详细描述了从样品准备到结果判定的完整流程:
样品准备：按照每个品种选取5株，样品等量混合分析，取稳定期叶片0.25g，液氮下迅速磨成粉末。
DNA提取：采用CTAB法提取高质量DNA，要求OD260/OD280比值1.6-2.0，并检测浓度和纯度。
PCR扩增：建立标准反应体系，使用荧光标记引物进行扩增。PCR反应体系总体积20μL，包含10×缓冲液、dNTPs、引物、Taq酶和DNA。反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10 min，产物4℃保存。
产物检测：提供两种检测方法：垂直板变性PAGE和荧光毛细管电泳。前者采用6%变性PAGE胶，1800V恒压电泳银染检测；后者使用DNA分析仪，将荧光标记的PCR产物与分子量内标混合后上样，通过片段分析软件读取等位变异大小。两种方法均需同时电泳参照品种以校正系统误差。
数据分析：根据参照品种确定等位变异大小，并记录纯合或杂合基因型。
五、标准主要内容
该标准规定了SSR分子标记鉴定橡胶树品种的原理、操作程序、数据采集和结果判定与表述。该标准适用于橡胶树品种鉴定和DNA指纹数据库构建。实验室应具备分子生物学基本设备，注意试剂配制用水应符合GB/T 6682要求，引物和参照品种宜从权威机构获取。对于等位变异范围外的条带，需通过参照品种校正。
表1 主要内容一览表
序号 | 主要内容 | 内容描述 |
1 | 代表性品种的选择 | 选取37个橡胶树主栽品种为代表性品种。 |
2 | 样本量确定 | 每个样品取5个单株。 |
3 | 改良CTAB法提取DNA | 提取的DNA应保证浓度与质量符合PCR扩增的要求，DNA无降解，紫外光吸光度OD260/OD280宜介于1.6-2.0。 |
4 | 核心SSR引物组合的筛选 | 从793对SSR引物中筛选出44对多态性丰富的SSR引物。 |
5 | 引物评价 | 通过荧光标记PCR扩增，得到带荧光基团的SSR标记产物，再进行毛细管电泳分离，根据筛选结果确定核心引物对序列。 |
6 | 核心SSR引物组合分组 | 将34对SSR核心引物分为16组，进行多重电泳。 |
7 | 橡胶树品种DNA指纹数据库的建立 | 挑选符合引物设计目标产物大小和重复单位特征的电泳峰，进行毛细管电泳图谱有效特征数据采集，构建橡胶指纹图谱。 |
8 | 核心引物的区分能力 | 通过对SSR位点进行抽样组合，计算不同SSR数量及不同组合情况下，对品种的识别率。 |
9 | 阈值确定 | 根据位点缺失率和一致率，将判定阈值定为2。 |
六、实施意义
该标准规定的SSR分子标记法的推广应用，将大幅提高我国橡胶树品种鉴定技术水平，有力支撑橡胶树品种权保护和市场监管，为我国天然橡胶产业高质量发展保驾护航。
